说明：本文内容均来源于以下论文
《Quantitative Immunocytofluorographic Analysis of CD4 Surface Antigen Expression and HIV Infection of Human Peripheral Blood Monocyte/Macrophages》
作者：SUZANNE CROWE, JOHN MILLS and MICHAEL S. McGRATH with technical assistance from PATRICIA LEKAS and NANCY McMANUS
发表于：《AIDS RESEARCH AND HUMAN RETROVIRUSES》1987 年第 3 卷第 2 期
 
Ø Savillex相关PFA实验器皿：
            
      Savillex PFA Jar             PFA Closure                PFA Well
Ÿ Savillex PFA制品优势：单核吞噬细胞不会贴附PFA材质表面，从而可维持悬浮状态；可干热灭菌。
Ø 论文摘要（翻译）：
单纯CD4阳性淋巴细胞的HIV感染并不能完全解释艾滋病的免疫功能障碍。被HIV感染的单核细胞/巨噬细胞可能作为病毒储存库，其功能异常且可将感染传播至其他易感细胞，因此在艾滋病免疫缺陷的发生发展中起核心作用。
传统玻片细胞免疫荧光染色法难以对感染细胞表面抗原进行定量分析及HIV抗原检测。我们开发了一种悬浮培养系统，可使单核细胞/巨噬细胞维持存活至少四个月。通过免疫细胞荧光单细胞分析技术，我们发现：
1. 单核细胞表面存在CD4抗原，且在培养前两周其表达量可增加十倍；
2. 与之相反，LeuM3抗原在长期培养过程中逐渐降至背景水平。
运用抗HIV p24抗体，我们证实单核细胞/巨噬细胞可被HIV感染，个别供体细胞的感染率高达70%。本文所述技术为体外定量研究HIV感染单核细胞/巨噬细胞导致艾滋病相关免疫缺陷的机制提供了方法学基础。
Ø 材料与方法（翻译节选）：
从HIV阴性供体白细胞层分离单核细胞的方法
HIV阴性血沉棕黄层用不含钙镁离子的杜氏磷酸盐缓冲液（PBS-CMF）按1:5比例稀释。取25ml稀释液置于50ml带盖聚丙烯离心管（Falcon 2070）中，室温下沿管壁缓慢加入15ml Ficoll-Hypaque分离液（Pharmacia）。所有离心步骤均需使用聚丙烯离心管以防止单核细胞贴壁导致的细胞数量减少。
密度梯度离心条件为：室温650×g离心20分钟，可形成清晰的白膜层。吸取白膜层细胞后，用PBS-CMF洗涤三次：首次离心200×g 10分钟以减少血小板污染（后续离心均为350×g 10分钟）。细胞重悬于含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基（每20ml培养基含1-5×10⁷个细胞），置于预温的150mm无菌玻璃培养皿中，37℃、5% CO₂湿润环境下孵育60分钟使贴壁细胞附着。
用温PBS轻柔洗涤3-5次去除非贴壁细胞，洗涤效果需经显微镜确认。加入含5%胎牛血清和0.2% EDTA的PBS-CMF，将培养皿置冰上15分钟使单核细胞从玻璃表面解离。使用一次性细胞刮刀收集细胞，PBS-CMF/5%胎牛血清洗涤两次后，重悬于含谷氨酰胺和庆大霉素的RPMI-1640/10%人AB+血清（斯坦福血库）中，最终浓度调整为2×10⁶细胞/ml，分装至聚四氟乙烯培养罐（Savillex）。选用聚四氟乙烯材质培养罐是基于单核吞噬细胞不会贴附其表面，从而可维持悬浮状态【1】。将带透气螺旋盖的聚四氟乙烯培养罐置于37℃、5% CO₂湿润培养箱中培养，每周更换培养基。
[1] VAN DER MEER, J.W., VAN DE GEVEL, J.S., and VAN FURTH, R. (1981). Teflon film as a substrate for the culture of mononuclear phagocytes, in: Methods for Studying Mononuclear Phagocytes. D.O. Adams, P.J. Edelson, and H.Koren (eds.). Academic Press: New York, pp. 121-133.
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